行为体验会激活稀疏分布的神经元中的 FOS 转录因子，这些神经元对于特定事件的编码和回忆至关重要。然而，对于经验如何驱动神经回路重组以建立 Fos 激活细胞网络的机制，人们了解有限。此外，尚不清楚 FOS 在此过程中是否仅作为近期神经活动的标记，还是有其他作用，以及其众多基因靶点中哪些是神经回路重组的基础。在此，我们证明当小鼠在新环境中进行空间探索时，表达副肌球蛋白的中间神经元对 Fos 激活的海马 CA1 锥体神经元的周身抑制增强，而表达胆囊收缩素的中间神经元的周身抑制减弱。当 FOS 转录因子复合物的功能被抑制时，这种双向抑制调节作用消失。中断。单细胞 RNA 测序、核糖体相关 mRNA 分析以及染色质分析，结合电生理学，揭示了 FOS 可激活编码多种不同神经肽的 Scg2 基因的转录，从而协调这些抑制性变化。由于表达副肌球蛋白和胆囊收缩素的中间神经元介导了锥体细胞活动的不同特征，因此可以预测，依赖于 SCG2 的抑制性突触输入的重新组织可能会影响体内网络功能。与这一预测一致的是，在缺乏 Scg2 的情况下，海马体的伽马节律和锥体细胞与θ相位的耦合显著改变。这些发现揭示了 FOS 和 SCG2 在通过重新连接局部抑制来建立 Fos 激活神经元网络方面具有指导作用，从而形成一种选择性调节状态。作用于不同抑制性通路的相反可塑性机制可能有助于随着时间的推移巩固记忆。

展开剩余97%

东莞富临医疗科技有限公司是 英坦科技（Intan Technologies） 亚洲代理商，为亚洲客户供应 英坦（Intan） 电生理产品与配套产品

一、介绍

神经元将新的经历转化为大脑中的稳定表征，以指导未来的行动。越来越多的证据表明，分布在大脑多个区域的稀疏神经元群构成了多种行为的神经基础。这些活跃的神经元群的一个显著特征是会短暂表达一组基因，即所谓的即刻早期基因，其中一种基因编码 FOS 转录因子。长期以来一直存在这样一种假设：一旦受到显著刺激的激活，表达 Fos 的神经元就会发生改变，从而有助于对经历的特定特征进行编码，以至于即使重新激活这些神经元中的一个子集，也足以唤起对最初经历的回忆。然而，这些神经元群是否会发生持久的改变，如果会，这些改变的性质及其潜在的分子机制仍不清楚。此外，Fos 的诱导除了作为近期神经活动的代理外，是否在协调编码经历所需的回路改变方面具有因果作用，这一问题仍未解决。在这方面，使进展变得复杂的是，Fos 转录因子家族（也称为 AP-1）至少包含七个部分功能冗余的成员——FOS、FOSB、FOSL1、FOSL2、JUN、JUNB 和 JUND。

海马 CA1 区的 Fos 激活神经元已被证明能稳定地编码情境信息，与未被 Fos 激活的神经元相比更是如此。由于 CA1 内的反复兴奋性连接较弱，锥体细胞（PCs）要么通过共同的兴奋性输入被协同调节，要么通过局部的抑制性γ-氨基丁酸释放（GABA 能）中间神经元（INs）网络进行调节。由于周身靶向中间神经元具有广泛的轴突树突，它们在控制锥体细胞群体的放电频率和持续时间方面具有独特的优势。在这方面，已描述了两种功能不同的周身抑制形式，分别由表达副肌球蛋白（PV）或胆囊收缩素（CCK）的中间神经元介导。副肌球蛋白中间神经元表现出快速、非适应性的放电模式，并且主要以前馈方式被激活，而胆囊收缩素中间神经元则以规则、适应性的脉冲串放电，并主要提供反馈抑制。周身抑制还被证明能协调行为状态依赖的网络振荡。例如，PV-IN 调节伽马节律，这对 PC 的瞬时同步至关重要，而 PV-IN 和 CCK-IN 在θ节律的不同阶段优先放电，θ节律与记忆编码或检索相关联。通过考虑每种 IN 亚型的输入如何选择性地改变到 Fos 激活的神经元上，我们推断应该有可能深入了解经验如何改变网络功能的时间动态以支持长期记忆。

我们首先测试了这两种形式的胞体周围抑制在表达 Fos 的神经元上与邻近的非 Fos 表达神经元相比是否受到不同的调节。我们让小鼠暴露于一系列新环境中（NEs），观察到这些环境仅在 CA1 神经元中激活了少量的 Fos（图 1a，扩展数据图 1a-d）。为了标记这些表达 Fos 的神经元，我们使用了一种先前开发的腺相关病毒（AAV）报告基因，该基因能选择性地在最近被激活的神经元中表达荧光蛋白 mKate2（图 1b）。利用这种报告基因，我们发现与在标准条件下饲养的小鼠相比，暴露于 2 至 3 天新环境的小鼠中最近被激活的 (mKate2+) 神经元数量显著增加（图 1c）。我们推断，因此 2 至 3 天这个时间点适合评估 FOS 及其延迟反应靶基因的长期影响，这些基因通常在刺激开始后的 1 至 12 小时内被激活（图 1d）。

图 1 | 双向周身抑制性可塑性。a，标准（Strd）或新环境（NE）饲养的示意图。b，实验时间线和基于腺相关病毒（AAV）的活动报告系统的配置。通过核定位信号（NLS）实现核 mKate2 标记，并通过多西环素（Dox）进行时间控制 14。IEG，即刻早期基因；pRAM，强效活性标记启动子；d2tTA，不稳定四环素转录激活因子；TRE，tTA 反应元件。c，左，标准饲养或 2 - 3 天新环境饲养的小鼠海马 CA1 区 Fos 激活神经元（红色）和 PV-IN 特异性 ChR2（绿色）的代表性图像。右，标准饲养（N = 13 只小鼠）和新环境条件（N = 10 只小鼠）下每平方毫米 mKate2+细胞的数量。比例尺，100 微米。****P = 2.6 × 10−10。d，Fos 激活的 CA1 神经元细胞体及其来自 PV-IN 或 CCK-IN 的周身靶向输入（用问号表示）的示意图。活动诱导基因表达动力学的示意图。在早期波中，表达即刻早期基因，如 Fos。FOS 随后激活晚期反应基因。e，i，将 ChR2 引入 PV-IN（e）或 CCK-IN（i）并测量的遗传策略示意图。光诱发的抑制性突触后电流。WT，野生型；s.p.，锥体层；s.r.，辐射层。f，Strd（左；n = 51/6）或NE（右；n = 58/7）条件下记录的mKate2-神经元对的散点图。显示了来自一对神经元的代表性轨迹；蓝色标记表示光开始。比例尺，100 pA，40 ms。g，f 中 PV-IPSC 幅度的平均值。****P = 3.2 × 10−6。h，f 中神经元对之间 PV-IPSC 幅度的归一化差异（方法；Δ 表示一对之间的幅度差，Σ 表示两个幅度之和）。***P = 3.4 × 10−4。j-l，与 f-h 相同，但为 CCK-IPSC。Strd，n = 60/7；NE，n = 48/8。比例尺，100 pA，40 ms（j）。在 k 中，**P = 5.5 × 10−3。在 l 中，*P = 0.014。m，IN 到 CA1 PC 的成对记录配置，PV-IN（左）和 CCK-IN（右）到 CA1 PC 对的代表性轨迹和 uIPSC 幅度。Veh.，溶剂；KA，海人藻酸。PV-IN 到 CA1 PC：溶剂，n = 13/6；KA，n = 19/7；**P = 0.003。CCK-IN 到 CA1 PC：溶剂：n = 16/9；KA，n = 16/4；**P = 9.6 × 10−3。比例尺，30 mV（IN 反应），20 pA（PC 反应），20 ms。双侧曼-惠特尼检验。n，归一化差异在给予溶剂或氯氮平 N-氧化物（CNO）处理 24 小时后，未转染（WT）和 hM3DGq（mCherry+）神经元对的 PV-IPSC（左）和 CCK-IPSC（右）振幅。PV（溶剂，n = 16/5；CNO，n = 16/7；**P = 0.006）；CCK（溶剂，n = 22/5；CNO，n = 21/7；*P = 0.014）。o，与 n 相同，但使用 Kir2.1。对照为非传导突变体（KirMut）。小鼠暴露于 NEs 7 - 10 天，在此期间许多 CA1 PCs 会表达 Fos（扩展数据图 1c，d）。PV（KirMut，n = 18/3；Kir2.1，n = 19/5；**P = 0.007）；CCK（KirMut，n = 25/3；Kir2.1，n = 17/4；*P = 0.023）。在 f、h、j、l、m - o 中，每个空心圆代表一对同时记录的神经元。在 f、j、m - o 中，n 表示为对数/小鼠数。数据为平均值 ± 标准误（c、f - h、j - o）；双侧 t 检验（c、h、l、n、o）；普通单向方差分析，校正多重比较（g、k）

为评估PV介导的抑制作用，我们通过Cre依赖型腺相关病毒（AAV）在 PVCre 小鼠中表达视紫红质通道蛋白2（ChR2），这些小鼠的PV中间神经元（PV-INs）表达Cre，从而能够通过局部光激活表达ChR2的PV特异性突触前小结，选择性地诱发PV介导的抑制性突触后电流（IPSCs）。我们在急性海马切片中对最近被激活的 (FOS+mKate2+) 和相邻未激活的 (FOS−mKate2−) CA1锥体神经元（PCs）进行双全细胞电压钳记录，这些切片是在最初暴露于新环境（NEs）后2-3天制备的（图1e）。我们发现，与标准条件或新环境条件下的 FOS−mKate2−neurons 神经元相比，PV-IPSCs在 FOS+mKate2+ 神经元中的平均幅度（311 ±24 pA（平均值 ± 标准误差））大1.7倍（分别为182 ±12 pA 和 181 ±16 pA）（图1f-h），这表明PV介导的抑制作用在Fos表达神经元上得到增强。相比之下，两组之间的其他电生理参数没有显著差异（扩展数据图1e）。

为评估由胆囊收缩素（CCK）介导的抑制作用，我们在 Dlx5/6Flp;CCKCre 小鼠中使用了 Flp 和 Cre 双重依赖型腺相关病毒（AAV），以特异性地在 CCK 抑制性神经元（CCK-INs）中驱动 ChR2 的表达，因为 CCKCre 驱动子本身会同时标记谷氨酸能和γ-氨基丁酸能神经元，而 Dlx5/6Flp 则仅在γ-氨基丁酸能抑制性神经元中引起 Flp 重组酶的表达（图 1i，扩展数据图 1f、g）。采用与上述实验类似的实验范式，我们发现，与 PV 介导的对 Fos 激活的 CA1 锥体神经元（PCs）的抑制作用选择性增强不同，CCK 诱导的 CA1 PCs 的平均抑制性突触后电流（IPSC）幅度（166 ± 18 pA，1.8 倍）显著小于在 FOS−CA1 神经元中的幅度（293 ± 27 pA）（图 1j - l）。

这些发现通过 IN 到 CA1 神经元的成对记录来测量单个 IPSC（uIPSC）的振幅得到了证实。记录是在暴露于海人酸 24 小时后，从 PVCre 或 Dlx5/6Flp; CCKCre tdTomato 报告小鼠制备的切片中进行的，以同步且可靠地激活几乎所有的 CA1 神经元（扩展数据图 1c、d）。与我们使用 ChR2 诱发的 IPSC 测量得出的结果一致，我们发现暴露于海人酸后，CA1 神经元中 PV-uIPSC 的振幅增大了 3.2 倍，而 CCK-uIPSC 的振幅则减小了 2.2 倍（图 1m，扩展数据图 2a-q）。

这些数据表明，暴露于 NEs 会导致 Fos 表达神经元集合体周围抑制的选择性、持久性双向变化，其中由 PV 介导的抑制作用增强。以及 CCK 介导的抑制作用减弱。此后，我们将这些变化称为“双向胞体周围抑制性可塑性”。

梭周抑制的双向变化是经验驱动的神经元活动的结果，而非 FOS+mKate2+ 和 FOS−mKate2− CA1 篮状细胞之间预先存在的差异的反映，因为通过化学遗传学激活表达 Gq-coupled DREADD 受体的神经元可以重现这种变化（图 1n，扩展数据图 3a-e）。相反，通过表达内向整流钾通道 Kir2.1 来沉默 CA1 篮状细胞，但不是表达不导电突变体（KirMut），会产生相反的效果（图 1o，扩展数据图 3f， g）。

01.Fos 家族转录因子的因果作用

由于双向周身抑制性可塑性的诱导仅在表达 Fos 的 CA1 神经元中选择性发生，我们考虑了 Fos 转录因子家族可能介导这些变化的可能性。我们首先确定了这七个家族成员中哪些会在海马体中因神经元活动而被诱导（图 2a）。我们发现，在膜去极化的海马体培养神经元中，Fos、Fosb 和 Junb 的表达量增加了约 100 倍或更多，而其他四个 Fos 家族成员的反应则明显较弱（图 2b）。因此，我们开发了一种三条件基因敲除小鼠品系 (Fosfl/fl;Fosbfl/fl;Junbfl/fl（以下简称 FFJ），以便在时空可控的方式下删除这些强诱导性 AP-1 因子，并通过单分子 RNA 荧光原位杂交（smRNA-FISH）和对这三种蛋白质的免疫染色，在体内验证了 Cre 表达时这些基因的有效切除（扩展数据图 4a-f）。

图 2 | Fos 家族转录因子的因果作用。a，可能的 AP-1 二聚化示意图。b，海马神经元在 KCl 介导的去极化后各 AP-1 成员的平均诱导倍数（全转录组测序），显示 Fos（****P = 9.1×10⁻⁵）、Fosb（**P = 0.008）和 Junb（****P = 2.2×10⁻⁷）的诱导倍数显著高于其他四种因子。n = 2 个生物学重复。c，FFJ 小鼠经 AAV 转导以稀疏表达 Cre（红色）。显示 CA1 区域的代表性图像。比例尺，100 微米。d，记录配置，刺激电极置于锥体层以测量周身 eIPSC，或置于辐射层以测量 Schaffer 边缘 eEPSC 或近端树突 eIPSC。e-g，FFJ-WT 和 FFJ-KO 神经元对之间指定药理学分离电流幅度的标准化差异：周身 eIPSC（e）、Schaffer 边缘 eEPSC（f）和近端树突 eIPSC（g）。e，溶剂，n = 26/6；KA，n = 33/7；**P = 0.005。f，溶剂，n = 18/5；KA，n = 17/4。g，溶剂，n = 30/4；KA，n = 30/6。h，将 ChR2 引入 PV-IN 并在 PVFlp；FFJ 小鼠的 CA1 区稀疏表达 Cre 的策略示意图。i，散点图图示为标准条件下（左；n = 16/3）或 7 - 10 天去甲肾上腺素（NE）条件下（右；n = 20/3）小鼠 FFJ-WT 和 FFJ-KO CA1 神经元对的记录图。图示为所展示神经元对的代表性轨迹；蓝色标记表示光刺激开始。标尺，左为 50 pA，右为 100 pA，40 毫秒。j，与 e - g 相同，为 i 中所展示的神经元对以及海人酸处理 24 小时后的结果（n = 19/3）。*P = 0.014（NE），**P = 0.002（海人酸）。普通单向方差分析，校正多重比较。k，FFJ-WT（N = 11）和 FFJ-KO（N = 12）小鼠在目标象限游泳所花费时间的比例。*P = 0.014（第 4 天）；0.016（第 5 天），其中第 1 天定义为训练开始。l，上，示例探查试验游泳轨迹。下，平均探查试验占用图（5 厘米网格）。m，平均试验游泳速度（左）和路径长度（右）的箱线图；小鼠如 k 所示。在箱线图中，中心线表示中位数，箱边缘表示上、下四分位数，须延伸至最小值和最大值，+ 表示异常值。在 e - g、i、j 中，每个空心圆代表一对同时记录的神经元；n 表示为对数/小鼠数。数据为平均值 ± 标准误（e - g、i - k）；双侧 t 检验（b、e - g、k、m）。

在通过表达 Cre 的腺相关病毒（AAV）对 Fos、Fosb 和 Junb 进行稀疏删除后（图 2c、d），我们对 FFJ 基因型野生型（FFJ-WT）和邻近的 FFJ 基因型敲除（FFJ-KO）CA1 神经元进行了双全细胞记录，同时对周身抑制性轴突进行电刺激。我们发现，与 FFJ-WT 激活神经元相比，FFJ-KO 神经元的药理学分离出的诱发性抑制性突触后电流（eIPSC）幅度降低了 1.7 倍（图 2e，扩展数据图 4g-i）。相比之下，在用载体或海人藻酸处理 24 小时后，FFJ-WT 和 FFJ-KO 神经元的 CA3 舒弗尔侧支诱发的兴奋性突触后电流（eEPSC）幅度或近端树突诱发的 eIPSC 幅度没有显著差异（图 2f、g，扩展数据图 4j-o）。因此，尽管 AP-1 原则上可以通过调节 CA1 神经元的 CA3 兴奋性输入或来自不同区室的抑制作用来调节 Fos 激活的 CA1 神经元，但 AP-1 因子对于周身抑制的调节是特异性必需的。

为了直接测量 PV 介导的抑制作用，我们生成了 PVFlp/Flp;FFJ 小鼠，这使得 ChR2 能够在 PV-IN 中特异性表达（图 2h）。对标准饲养的小鼠进行切片记录，同时记录 FFJ-WT 和相邻 FFJ-KO 神经元中 ChR2 诱发的 PV-IPSC，结果显示两者之间没有差异（图 2i）。然而，在经历 7 - 10 天的 NE 后，FFJ-KO 细胞中 PV-IPSC 的振幅显著降低，90% 的 FFJ-KO 细胞的 IPSC 振幅小于 FFJ-WT 细胞的平均值（图 2i， j）。这些数据表明，AP-1 因子对于经验依赖性的 PV 介导抑制的募集是必需的，并且揭示了 AP-1 因子在长期可塑性中此前未被发现的作用。

鉴于 AP-1 的缺失会导致抑制缺陷，我们接下来测试了在这些条件下空间学习和记忆是否受到影响。将表达 Cre 的 AAV 或催化失活的 ΔCre 的 AAV 双侧注射到 FFJ 小鼠的 CA1 区域，并在莫里斯水迷宫范式中对其进行评估。与 FFJ-WT 小鼠相比，FFJ-KO 小鼠在该空间任务中的表现明显更差，并且无法学会迷宫中平台的位置（图 2k、l）。我们观察到两组之间的平均游泳速度或路径长度没有显著差异，这表明 FFJ-KO 小鼠的空间学习缺陷并非由运动缺陷所致（图 2m）。这些结果表明Fos 激活神经网络中周质抑制性可塑性的变化可能有助于海马体依赖的空间学习。

02.CA1 锥体神经元中的 FOS 目标

尽管目前已确定了许多活动调节基因（ARGs），但在体内有效干扰 AP-1 功能的困难，使得难以识别出那些由 AP-1 因子特异性调控、从而可能介导周身抑制双向调节的基因。此外，由于活动依赖性基因程序在神经元细胞类型间存在显著差异，这进一步阻碍了 AP-1 目标基因的鉴定，而且还不清楚在大脑几乎所有细胞类型中都被诱导的 AP-1 因子是如何促成这种多样性的。为了解决这些难题，我们采用了一系列全基因组方法来鉴定高可信度的 AP-1 目标基因，重点关注 CA1 锥体细胞。我们确定了（1）CA1 锥体细胞中的 ARGs；（2）表达水平降低的（1）当 AP-1 功能受到干扰时的表达情况；（2）在附近调控 DNA 元件上显示出活性依赖性 FOS 结合的基因。为了进行这些分析，我们用海人酸处理小鼠，以强烈激活 CA1 区几乎所有的细胞，从而最大限度地提高基因识别的信噪比。通过这种方法鉴定出的感兴趣的 AP-1 目标基因随后在更接近生理条件的去甲肾上腺素暴露下进行了验证。

03.全基因组方法

我们首先通过分析细胞类型特异性核糖体相关 mRNA 来定义 CA1 神经元中特异性的应激反应基因（ARGs）（图 3a）。利用 CaMK2aCre;Rpl22-HA（核糖体标签）小鼠的 CA1 组织，这些小鼠分别接受了 6 小时的溶剂或海人酸处理，我们对 CaMK2a 特异性核糖体相关 mRNA 进行了免疫沉淀和测序。对差异表达基因的分析确定了 795 个至少上调两倍（错误发现率（FDR）≤0.005）的 ARGs，其中 111 个在 CaMK2a 阳性神经元中相对于其他细胞类型（包括 PV-INs）显著富集（图 3b，扩展数据图 5a）。

图 3 | CA1 锥体神经元中的 FOS 目标。a、c、f，Ribotag（a）、FFJ snRNA-seq（c）和 FOS CUT&RUN（f）的工作流程。b，散点图显示海人酸处理 6 小时后与溶剂对照相比的 CaMK2a 特异性 ARG。显著差异的基因以绿色表示；FDR ≤ 0.005。CaMK2a 富集（免疫沉淀（IP）与输入相比）的基因以红色额外表示。点代表平均值 ± 标准误差。每种生物重复 n = 4 只小鼠；每种条件 3 个生物重复。d，Cre+ 和对照 FFJ snRNA-seq 的细胞核 UMAP 可视化，叠加了细胞类型信息（左）或基因型分配（右）。对照，Cre− 细胞在未转导的半球；Cre-GFP，Cre+ 细胞在注射的半球；其他，Cre− 细胞在注射的半球或 Cre+ 细胞在未转导的半球。n = 58，536 个细胞，6 只小鼠。e，CA1 兴奋性簇中基因的火山图。y 轴显示 -log10 Bonferroni 校正的 P 值（双侧 Wilcoxon 秩和检验）。倍数变化是根据 Cre+ 细胞与对照细胞计算的。每个点代表在至少 5% 的未转导细胞中检测到的基因。浅灰色，P ≥ 0.05（n = 3，429）；深灰色，倍数变化g, 聚合图显示了 CaMK2a-SUN1 CUT&RUN 中所有 FOS 峰的每个区间内经 spike-in 标准化后的 FOS 覆盖率的平均值。IgG 作为特异性对照。每种生物学重复样本使用 1 只小鼠，每种条件有 3 种生物学重复。h， 维恩图展示了来自 CaMK2a-Ribotag（变化倍数≥2）、FFJ snRNA-seq（FFJ-KO 细胞中表达降低≥20%）和 CUT&RUN（FOS 峰位于 TSS 上游或下游 10 kb 范围内）的显著 CA1 PC 特异性基因的交集。c 图（中间）的示意图经许可改编。

为了确定在 AP-1 功能受损时哪些基因表达量降低，我们使用 FFJ 小鼠进行了高通量单细胞核 RNA 测序（snRNA-seq）。将表达 Cre-GFP 或 ΔCre-GFP 的腺相关病毒（AAV）注射到小鼠的一个 CA1 半球，将对侧半球的细胞作为未转导的对照。小鼠接受海人酸处理，4 小时后分离 CA1 核，随后使用平台进行分选（图 3c）。我们对从 6 只 Cre+ 和 4 只 ΔCre + 小鼠中分离出的 83,750 个单细胞转录组进行了测序（图 3d，扩展数据图 5b-e）。使用单细胞分析流程将细胞核聚类为 12 - 15 种细胞类型（图 3d）。利用病毒来源转录本的存在来识别 17,027 个 Cre+ 和 14,557 个 ΔCre + 核。对于每种细胞类型，通过将 Cre+（或 ΔCre +) 核与各自的未转导对照进行差异基因表达分析，以确定 AP-1 调控的基因，其中许多是细胞类型特异性的（扩展数据图 5f， g）。这些数据支持了长期以来但此前未经证实的假设，即 AP-1 对 ARG 表达的细胞类型差异有贡献。具体而言，在 CA1 兴奋性神经元群中，我们发现有 696 个基因在没有 AP-1 的情况下显著下调了至少 20%（图 3e，扩展数据图 5e-h）。

最后，我们利用 CUT&RUN 技术（一种通过原位抗体靶向控制微球菌核酸酶的切割来释放特定 FOS-DNA 复合物以进行测序的染色质分析策略）确定了 CA1 神经元中 FOS 的可能直接靶基因（图 3f）。通过基于 Cre 依赖性表达的 GFP 标记的内核膜蛋白 SUN1 对 CaMK2aCre;LSL-Sun1-sfGFP-Myc 小鼠的 CaMK2a 表达 CA1 核进行分选。与溶媒处理相比，我们从暴露于海人酸 2 - 3 小时的小鼠中鉴定出 3295 个 FOS 结合的活性反应位点，其中 1109 个基因在转录起始位点（TSS）上下游 10kb 范围内至少有一个 FOS 结合的调控元件（图 3g，扩展数据图 6a - f，补充图 1）。

04.数据交叉验证

三个数据集的交叉部分确定了 17 个基因，这些基因在 CA1 神经元中可由活动诱导（CaMK2a-Ribotag），在 AP-1 缺失时表达降低（FFJ snRNA-seq），并且在附近的调控元件上结合 FOS（CaMK2a-SUN1 FOS CUT&RUN）。另外还有 190 个基因出现在三个数据集中的两个（图 3h，补充表 1）。我们重点关注了三个高置信度的 AP-1 调控候选基因，它们具有高倍数诱导，并且在 CA1 神经元中表达丰富（Inhba、Bdnf 和 Scg2），以及另外三个先前已被证明参与抑制性可塑性的基因，并且出现在三个基因组数据集中的两个（Rgs2、Nptx2 和 Pcsk1）（扩展数据图 6g-k、7a）。

05.依赖 FOS 的抑制效应因子

为了确定 FOS 激活下游双向周身抑制性可塑性的分子效应因子，最初采用短发夹 RNA（shRNA）介导的基因敲低技术，以确定这六个候选基因中是否有任何基因可能介导 PV 介导的抑制的活动依赖性增强。在验证了神经元中的敲低效率（扩展数据图 7b）以及对整体神经元存活率无不良影响后，将单个 shRNA 克隆到 Flp-OFF AAV 中，通过 Flp 重组酶实现有效载荷失活，并在使用 Dlx5/6Flp 小鼠时排除 GABA 能中间神经元中的 shRNA 表达（图 4a、b，扩展数据图 7c，补充图 2a）。

图 4 | FOS 依赖性抑制效应子。a、b，Flp-OFF shRNA AAV 构建体示意图（a）和所用记录策略（b）。CAG，CAG 启动子；FRT，FRT 模块；U6，U6 启动子。c，海人酸处理 24 小时后 shRNA− 和 shRNA+ 突触后细胞（PCs）对 PV-IPSC 振幅的标准化差异。对照组，n = 17/9；Inhba，n = 15/4；Rgs2，n = 20/3；Bdnf，n = 26/10；Nptx2，n = 16/3；Pcsk1，n = 17/6；Scg2#1，n = 17/7（**P = 0.002）；Scg2#2，n = 17/6（*P = 0.016）。普通单向方差分析，多重比较校正。d，图 c 中 Scg2#1 shRNA 记录的 PV-IPSC 振幅散点图。显示一对神经元的代表性轨迹；蓝色标记表示光照开始。n = 17/7。比例尺，100 pA，40 ms。e，与 c 相同，Scg2#1 shRNA 在标准（n = 14/5）或 7 - 10 天 NE（n = 16/4）条件下。*P = 0.048。f，SCG2 蛋白示意图，描绘了四个由 SCG2 衍生的神经肽和九个二碱性（KR、RK 或 RR）切割位点。g，CaMK2a-Ribotag 中的 Scg2 表达（图 3b），显示海人酸处理 6 小时后的诱导和富集（IP 对比输入）。h，描绘 Cre 或 ΔCre 中 CA1 PCs 中 Scg2 表达的箱线图。分别来自 FFJ snRNA-seq 的对照（图 3e）。TPT，每 10，000 个读取的标签数。****P = 2.9×10−182 且减少≥20%。数据为平均值±2×标准差。i，显示 Scg2 位点周围 FOS 结合位点的 CUT&RUN 轨迹（图 3g）。y 轴显示归一化到所显示位点观察到的最大值（括号内）的掺入标准化覆盖度。j，暴露于标准条件和 6 小时 NE 条件的小鼠 CA1 的代表性 smRNA-FISH 图像，探针为 Fos（品红色）、成熟 Scg2（红色）和内含子靶向 Scg2（绿色）转录本（低倍放大图见扩展数据图 7h）。标准，N = 4；NE，N = 6 只小鼠。比例尺，20 微米。k，显示 j 中 smRNA-FISH 每个细胞斑点数的箱线图。虚线表示中位数和四分位数，每个点代表一个细胞。标准，n = 909；NE，n = 1，548 个细胞。****P < 1×10−15。l，顶部，NE snRNA-seq 的工作流程。小鼠短暂暴露于 NE（5 分钟），然后返回标准饲养环境 1 小时或 6 小时，之后解剖 CA1。底部，CA1 神经元细胞中归一化基因表达的箱线图（n = 1，659 个细胞，经过下采样）。标准，N = 2 只小鼠；NE（1 小时和 6 小时），每组 N = 4 只小鼠。Fos：****P = 4.2×10−9，*P = 0.025；Scg2：P = 2.2×10−16，*P = 0.032；Actb：*P = 0.014。在 c-e 中，每个空心圆代表一对同时记录的神经元，n 表示为对数/小鼠数。数据为平均值 ± 标准误（c-e，g）；双侧 t 检验（e，k）；双侧 Wilcoxon 秩和检验（h，l）。

在稀疏转导神经元之后，我们通过光刺激表达 PV 特异性 ChR2 的突触小结，在 24 小时前接受过海人酸处理的 Dlx5/6Flp;PVCre 小鼠中，同时测量了相邻的 shRNA 阳性(mCherry+)和阴性(mCherry—)平衡细胞（PCs）的 PV-IPSC（图 4b）。我们发现，表达对照 shRNA 或针对 Inhba、Rgs2、Nptx2 或 Pcsk1 的 shRNA 对 PV-IPSC 的幅度没有影响，而敲低 Bdnf 仅导致幅度略有下降（图 4c，扩展数据图 7d）。相比之下，两种独立的针对 Scg2 的 shRNA 均显著降低了 PV 介导的抑制作用（图 4c、d，扩展数据图 7e）。在更接近生理条件的去甲肾上腺素暴露情况下也观察到了类似的结果。小鼠被稀疏转导了表达 Cre 的 AAV，同时共注射了 AAV mKate2 活性报告基因（图 1b）以及一个单独的 Flp 依赖型 AAV，以将 ChR2 表达定位到 PV-IN（图 5c）。随后，我们让这些小鼠接受 2-3 天的 NE 处理，并在相邻的 Fos 激活神经元中同时记录光诱发的 PV-IPSC，这些神经元中 Cre 的表达情况分别为阳性（Scg2-KO Cre+mKate2+)）和阴性（Scg2-WT Cre−mKate2+)）（图 5c）。与 shRNA 介导的 Scg2 敲低所获得的数据一致，我们发现 Fos 激活的 Scg2-KO 神经元中 PV-IPSC 的幅度平均比 Scg2-WT 神经元小三倍（图 5d、e）。在标准条件或 NE 条件下，非 Fos 激活的(mKate2−)神经元中均未观察到这种效应（图 5d、e）。因此，Fos 激活的 CA1 神经元需要 Scg2 来诱导 PV-IN 突触的可塑性。

图 5 | Scg2 介导双向周身抑制性可塑性。a，使用 CRISPR-Cas9 生成 Scg2fl/fl 小鼠品系的策略示意图。CDS，编码序列；UTR，非翻译区。b，通过 smRNA-FISH 验证 Scg2fl/fl 与 Emx1Cre 杂交以在所有兴奋性细胞中切除 Scg2。每条线 N = 2 只小鼠。比例尺，20 微米。c，将 ChR2 引入 PVFlp;Scg2fl/fl 小鼠的 PV-INs 的策略示意图，用病毒 mKate2 活性报告标记最近活跃的细胞，并稀疏转导 CA1 PCs 中的 Cre。d，暴露于 NE 2 - 3 天后记录的 mKate2−（左；n = 21/4）或 mKate2+（右；n = 22/9）的 Scg2-WT 和 Scg2-KO 神经元对的散点图。显示了神经元对的代表性轨迹；蓝色标记表示光起始。比例尺，50 pA，40 毫秒。e，d 中神经元对与标准饲养条件下 mKate2−对（n = 22/5）之间 PV-IPSC 振幅的标准化差异。**P = 0.004，***P = 1.4 × 10−4。普通单向方差分析，多重比较校正。f，用于在 Scg2fl/fl 小鼠中分离 CCK-IPSC 的药理学策略示意图。使用了 NBQX、(R)-CPP（N-甲基-D-天冬氨酸拮抗剂）和 ω-阿加托毒素 IVA（以阻断 PV-IPSCs）。g、h，与 d、e 中的情况相同，但针对的是 CCK-IPSCs。mKate2−，n = 22/6；mKate2+，n = 26/6。比例尺，100 pA，40 毫秒。**P = 0.001。i - k，与 e、h 中的情况相同，针对的是 i、j 中所描绘的神经元对。i，PV：野生型，n = 22/5；9AA，n = 23/4，****P = 1.2 × 10−5；CCK：野生型，n = 27/3；9AA，n = 23/4，**P = 0.005。j，PV：n = 20/5，**P = 0.001；CCK：n = 25/3，**P = 0.004。k，PV：n = 19/4；CCK：n = 16/3。在 d、e、g - k 中，每个空心圆代表一对同时记录的神经元；数据为平均值 ± 标准误；n = 神经元对数/小鼠数。双侧 t 检验（h、i）；双侧单样本 t 检验，假设均值为 0（j、k）。

接下来，我们研究了 Scg2 是否也调节 CCK 介导的抑制作用。由于缺乏仅作用于 CCK-IN 的 Flp 驱动品系，我们采用了两种正交方法来测量 CCK-IPSC。首先，我们采用了一种药理学策略，通过使用 ω-阿加托毒素 IVA 特异性阻断 PV-IPSC 来测量 CCK-IPSC。在 NE 暴露 2-3 天后，对 Scg2-WT(Cre−mKate2+)和 Scg2-KO(Cre+mKate2+)神经元成对同时记录显示，在 Fos 激活时，Scg2-KO 神经元的 CCK-IPSC 平均振幅是 Scg2-WT 神经元的两倍（图 5f-h）。使用我们的交叉遗传策略，结合 Dlx5/6Flp;CCKCre 小鼠和 shRNA 介导的 Scg2 敲低的独立方法也得到了类似的结果（扩展数据图 8b-f）。因此，单个经验调节的 AP-1 目标 Scg2 将 PV 和 CCK 介导的抑制作用双向调节耦合到 Fos 激活的神经元上。

这些发现通过一系列的拯救和过表达实验得到了进一步的证实。值得注意的是，在 shRNA 介导的敲低或 Scg2fl/fl 敲除实验中，当外源性表达 Scg2 时，PV 和 CCK 介导的抑制缺陷均恢复到了对照水平（图 5i，扩展数据图 8g、9a-d）。此外，我们比较了 Scg2 过表达（Scg2-OE）神经元和相邻对照（Scg2-WT）神经元中光诱发的 PV 或 CCK-IPSC 的振幅，在没有神经活动的情况下，发现 SCG2 的功能获得足以分别增强 PV 和削弱 CCK 介导的抑制（图 5j，扩展数据图 9e、f）。

已知 SCG2 前体的裂解会产生多种可能具有不同功能的神经肽（图 4f）。鉴于 SCG2 的裂解是由一系列内部二碱性残基所引导的，我们生成了一种裂解抗性形式的 SCG2，其中的九个二碱性序列被突变为丙氨酸（9AA-Mut）。首先，我们验证了这些序列变化不会影响 SCG2 的表达水平（扩展数据图 9g，补充图 2b），然后发现表达这种裂解缺陷型 SCG2 并不能重现过表达野生型 SCG2 的效果（图 5k，扩展数据图 9h，i），也不能挽救 Scg2 缺失所产生的影响（图 5i，扩展数据图 9c，d）。因此，虽然我们不能正式排除 SCG2 的其他作用模式，例如对致密核心囊泡生物发生或神经肽包装入致密核心囊泡的作用，但在跑步时，Scg2 基因敲除小鼠的快速伽马波（60-90 赫兹）功率显著低于野生型小鼠（图 6b、c，扩展数据图 10b、c）。相比之下，Scg2 基因敲除小鼠和野生型小鼠的θ波（4-12 赫兹）功率和平均放电率没有显著差异（图 6b、c，扩展数据图 10b-g）。

图 6 | Scg2 对体内网络节律的维持是必需的。a，硅探针在 CA1 锥体层中的放置示意图（左）和固定头部清醒行为实验装置（右）。AAV 注射后，小鼠每天接受 NE 处理 1 - 2 周，然后进行记录。b，正常化功率谱：在跑步状态下 Scg2-WT（灰色，N = 4）或 Scg2-KO（绿色，N = 5）小鼠的网络振荡；每只小鼠记录一次。AU，任意单位。c，跑步状态下如 b 所示的θ、慢γ和快γ频段的正常化功率谱均值。双侧 t 检验，**P = 0.009。d，假定 CA1 锥体细胞的θ相位调制。显示两个θ周期。上部，Scg2-WT（灰色，n = 67）和 Scg2-KO（绿色，n = 103）单位的平均脉冲触发θ相位分布。***P < 0.001，两个分布圆均值差异的自助显著性检验；1000 次洗牌。中部，每个单位的平均θ相位和平均结果长度。下部，每个θ相位区间（10°区间）的脉冲分数。e，模型描绘了 CA1 锥体细胞中 Fos 激活时围绕胞体的抑制性网络的经验依赖性重组，其中 PV-IN 和CCK-IN 突触输入受到双向调节。数据为平均值 ± 标准误。（b - d）a 中的示意图（左）经许可改编。

此外，我们发现 Scg2-KO 小鼠 CA1 锥体层中的 PC 细胞在 thetapyr 相位上的放电情况与 Scg2-WT 小鼠的 PC 细胞显著不同（图 6d）。Scg2-KO 细胞在 thetapyr 周期中倾向于更晚放电，对应于 thetapyr 的上升期，而 Scg2-WT 细胞平均在 thetapyr 周期的下降期放电（相对于 thetapyr 峰值（0°），Scg2-WT 为 120.6°，Scg2-KO 为 187.3°）。这些结果与 Scg2 缺失时 PV-IN 和 CCK-IN 输入平衡的变化一致，因为已观察到 PV-IN 和 CCK-IN 分别在 thetapyr 振荡的下降期和上升期放电。

二、讨论

尽管 Fos 激活的神经元网络在大脑的许多区域普遍存在，但对于这些网络如何持续地发生改变以支持经验的长期巩固，人们了解甚少。此外，FOS 是否在协调回路改变方面具有因果作用，以及其众多靶点中哪些参与了这些过程，目前尚不清楚。在此，我们揭示了一种双向的胞体周围抑制性可塑性机制，通过这种机制，Fos 激活的回路会根据经验进行选择性重组（图 6e）。我们表明，FOS 到 SCG2 的通路对于这种重组至关重要，并进一步明确了 SCG2 神经肽能调节在 PC 活动相对于θ波相位的同步以及γ节律调节中的作用。这些结果，加上我们发现 FOS 对空间学习是必需的，提示 Fos 依赖的回路重组可能对于建立用于编码和回忆记忆的细胞网络是必需的。尽管 PV-IN 和 CCK-IN 在 CA1 锥体细胞层内具有广泛的轴突分支，但与未激活 Fos 的网络相比，特定的机制似乎专门对激活 Fos 的微回路进行重组和建立。新经验对 PV-IN 和 CCK-IN 突触强度的相反调节表明，这种重组的功能后果超出了严格的稳态作用，即增加的 PC 活动通过网络内增加的胞体。

三、方法

未使用统计学方法预先确定样本量。除下文另有说明外，研究者在实验过程中及结果评估时均未设盲。

01.老鼠

实验小鼠的处理均遵循哈佛大学动物护理常设委员会批准的方案，并符合联邦指导方针。所用小鼠品系如下：PV-Cre、CCK-Cre、PV-Flpo、C57BL/6J、Ai14、Ai65、CaMK2a-Cre、Rpl22-Ribotag、LSL-Sun1-sfGFP-Myc、Emx1-Cre、Dlx5/6-Flp、Fosfl/fl;Fosbfl/fl;Junbfl/fl、Fos-FlagHA、Npas4-FlagHA、C57BL/6N和Scg2fl/fl。

条件性基因敲除Scg2fl/fl小鼠是在哈佛基因组修饰设施的帮助下获得的。简而言之，在Scg2的整个编码外显子两侧引入了LoxP位点。将Cas9 mRNA、两个分别针对LoxP插入位点的sgRNA以及两个用于修复的150-200个碱基对的单链寡核苷酸注入C57BL/6J小鼠受精卵中。通过标准PCR和Sanger测序验证了两个LoxP位点的正确顺式插入。将创始雄性与C57BL/6J小鼠交配至少三代后用于实验。

小鼠被饲养在通风的微隔离笼中，置于温度和湿度受控的环境中，光照/黑暗周期为标准的12小时制，自由获取食物和水。在所有实验中，雄性和雌性同窝小鼠以相似的比例使用，并被分配到对照组和实验组。对于体内硅探针记录和莫里斯水迷宫实验，仅使用雄性同窝小鼠，且其饲养环境的光照/黑暗周期为反向的12小时制。

02.新环境范式

断奶年龄及以上的动物（> P21）被置于一个大的不透明笼子（0.66米×0.46米×0.38米）中，与其他小鼠分组饲养，笼内配备有各种丰富设施，包括跑轮、迷宫、隧道、梯子、小屋、秋千以及不同种类的动物垫料。在迷宫中藏有啮齿动物颗粒饲料，以鼓励空间探索。小鼠被置于特定环境中12至24小时。随后每天显著改变环境，以提供新的多感官体验，并转录激活更大比例的神经元。

03.腹腔注射

对于海人酸处理，小鼠腹腔注射海人酸（K0250），用0.001 N NaOH在PBS中配制，剂量为5-10毫克kg−1用于电生理学研究，或15-20毫克kg−1用于基因组或组织学分析。我们分别使用1-1.5小时或2-3小时的海人酸处理作为时间点，以捕获即刻早期基因（例如Fos）RNA或蛋白质诱导的峰值。对于晚期反应基因的新生RNA诱导峰值捕获，我们使用4小时海人酸处理作为时间点，因为新生RNA分子首先出现在细胞核中（FFJ snRNA-seq）。随后，对于晚期反应基因的核糖体相关成熟RNA，我们使用6小时海人酸处理作为时间点，因为我们认为在这一较晚的时间点，更多的成熟RNA会与核糖体结合（Ribotag）。对于电生理学研究，小鼠在海人酸注射24小时后被处死，以确保有足够的时间让活动依赖性基因表达并发挥作用，但又远早于任何可测量的癫痫相关细胞毒性出现（见扩展数据图2m-q）。

对于化学遗传激活实验，将CNO（C0832）用0.4% DMSO在PBS中复溶，于电生理实验前24小时以5毫克/公斤的剂量腹腔注射到小鼠体内。

04.立体定向手术

对于急性海马切片记录，选用P13-15日龄的雌雄各半的小鼠，通过吸入异氟烷（诱导浓度2%，维持浓度1%）进行麻醉，并将其置于立体定位仪中。使用加热垫将动物体温维持在37°C。所有手术均按照哈佛大学动物护理常设委员会批准的方案进行，并符合联邦指南。用剃毛器剃去头皮周围的毛发，并用碘伏和70%乙醇交替清洗三次进行消毒。在海马CA1区域上方钻孔（ML：±2.9毫米；AP：−2.4毫米；DV：−2.8毫米），以便用直径约50微米的玻璃吸管对该区域进行精确定位。以150纳升/次的速度注射1000纳升腺相关病毒（AAV）病毒min−1，在完成病毒注射后，将吸管留在原位5分钟，以利于病毒扩散。所有动物术后均给予止痛药（氟尼辛，2.5毫克kg−1），并在术后72小时内每隔12小时追加一次注射。

05.病毒载体和滴度

所用的所有腺相关病毒（AAV）均由制备，均为AAV2/1型。对于稀疏转导，病毒以每海马半球1×10⁻8质粒拷贝（gc）的剂量注射。对于密集转导，病毒以每海马半球2×10⁻9 gc的剂量注射。病毒载体及其原始滴度如下：pAAV-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP（20298，1.75×10⁻13gc ml−1），pAAV-EF1a-fDIO-hChR2(H134R)-EYFP（55639，1.39×10⁻13gc ml−1），pAAV-hSyn-Con/Fon-hChR2-EYFP（55645，2.25×10⁻14gc ml−1），pAAV-pRAM-tTA::TRE-NLS-mKate2-WPREpA（84474，2.25×10⁻13gc ml−1），pAAV-CAG-Cre-GFP（1.75×10⁻13gc ml−1），pAAV-CAG-Cre-mCherry（9.10×10⁻12gc ml−1），pAAV-CAG-Cre-mTagBFP2（2.97×10⁻12gc ml−1），pAAV-CAG-deltaCre-GFP（2.79×10⁻12gc ml−1），pAAV-FlpOFF-u6-shRNA-CAG-mCherry：对照shRNA（ACTTACGCTGAGTACTTCG）（5.08×10⁻13gc ml−1），Inhba（CCTTCCACTCAACAGTCATT）（4.62×10⁻13gc ml−1），Bdnf（GAATTGGCTGGCGATTCATA）（6.97×10⁻13gc ml−1），Pcsk1（GATAATGATCATGATCCATT）（6.02×10⁻12gc ml−1），Nptx2（GAAGACATTGCCTGAGCTGT）（1.30×10⁻12gc ml−1），Scg2#1（GCAGACAAGCACCTTATGAA）（8.11×10⁻11gc ml−1），Scg2#2（CCCTTGA TTCTCAGTCTATT）（2.75×10⁻13gc ml−1），Rgs2（GCTCCCAAAGAGATAAACAT）（6.14×10⁻12gc ml−1），pAAV-CaMKIIa-mCherry（3.80×10⁻12gc ml−1），（1.20×10⁻12gc ml−1），pAAV-hSyn-FlpOFF-Kir2.1-T2A-mCherry（2.26×10⁻12gc ml−1），pAAV-hSyn-FlpOFF-Kir.2.1（突变体）-T2A-mCherry18（1.28×10⁻12gc ml−1），pAAV-u6（Frt）-Scg2#1 shRNA-CAG-Scg2（抗shRNA）-1×HA-T2A-mCherry-Frt-SV40（1.88×10⁻12gc ml−1），pAAV-CAG-DIO-Scg2（野生型）-3×HA-bGH polyA（8.22×10⁻13gc ml−1），pAAV-CAG-DIO-Scg2（9AA突变体）-3×HA-bGH polyA（6.13×10⁻13gc ml−1），pAAV-CAG-Scg2（野生型）-1×HA-T2A-mCherry-bGH polyA（1.08×10⁻13gc ml−1）和pAAV-CAG-Scg2（9AA突变体）-1×HA-T2A-mCherry-bGH polyA（3.71×10⁻12gc ml−1）。

对于shRNA的慢病毒生产，使用慢病毒骨架质粒pSicoR（11579）对所有shRNA进行克隆。将10毫克慢病毒质粒与第三代包装载体pMD2.G（12259）、pRSV-rev（12253）和pMDLg/pRRE（12251）一起转染到10厘米培养皿中的293T细胞中。转染后12-16小时，将293T细胞培养基更换为含有B27补充剂（2%）、青霉素（50 U ml−1）、链霉素（50 U ml−1）和谷氨酰胺（1 mM）的Neurobasal培养基。在转染后36小时收集含有病毒的上清液，以1000g离心5分钟去除细胞碎片，然后直接加入培养的神经元中。

06.急性切片制备

从P23-P32日龄的小鼠身上制备横切海马切片。小鼠用氯胺酮/赛拉嗪麻醉，然后用冰冷的胆碱基人工脑脊液（胆碱-ACSF）进行心脏灌注，该溶液与95% O2/5%CO2平衡，其成分（以毫摩尔计）为：110氯化胆碱、25碳酸氢钠、1.25 NaH2PO4、2.5氯化钾、7氯化镁、25葡萄糖、0.5氯化钙、11.6 L-抗坏血酸钠和3.1氢氧化钠。迅速取出大脑半球并放入冰冷的胆碱-ACSF中。将组织快速切块并转移到振动切片机中。收集300微米厚的海马背侧切片，放入含有以下成分（以毫摩尔计）的保存室中：127氯化钠、25碳酸氢钠、1.25 NaH2PO4、2.5氯化钾、1氯化镁、10葡萄糖和2氯化钙。所有溶液的pH值均设为7.2，渗透压设为300毫渗摩尔。切片在32°C下孵育20分钟，然后在室温（22°C）下保持30分钟，之后开始记录。所有记录均在切片制备后的4-5小时内在室温下进行。通过荧光显微镜评估AAV转导情况。对于旨在对CA1区进行稀疏转导的实验，使用了CA1神经元感染率为10%-30%的切片，感染率超过30%的切片则不再用于后续分析。对于光遗传学刺激实验，使用了ChR2在整个CA1区均有表达的切片，而CA1区ChR2表达不完全的切片则不再用于后续分析。对于所有实验，AAV转导扩散至CA3区和/或齿状回区域的切片均被丢弃。

07.体外电生理学

对于全细胞电压钳记录，所有抑制性突触后电流（IPSC）测量均使用一种基于氯化铯的内溶液，其成分（以毫摩尔计）为：135毫摩尔氯化铯、3.3毫摩尔QX314-氯化物、10毫摩尔HEPES、4毫摩尔MgATP、0.5毫摩尔NaGTP、8 Na2-phosphocreatinine、1.1毫摩尔EGTA和0.1毫摩尔氯化钙（pH值7.2，渗透压290毫渗摩尔）。所有兴奋性突触后电流（EPSC）测量均使用一种内溶液，其成分（以毫摩尔计）为：127毫摩尔甲磺酸铯、10毫摩尔氯化铯、10毫摩尔HEPES、0.5毫摩尔EGTA、2毫摩尔氯化镁、0.16毫摩尔氯化钙、2毫摩尔MgATP、0.4毫摩尔NaGTP、14 Na2-phosphocreatinine和2毫摩尔QX314-氯化物（pH值7.2，渗透压295毫渗摩尔）。所有电流钳记录均使用一种内溶液，其成分（以毫摩尔计）为：142毫摩尔K+-gluconate、4毫摩尔氯化钾、10毫摩尔HEPES、4毫摩尔MgATP、0.3毫摩尔NaGTP、10 Na2-phosphocreatinine和1.1毫摩尔EGTA（pH值7.2，渗透压280毫渗摩尔）。膜电位未对液接电位进行校正（实验测得基于氯化铯的内溶液的液接电位为-5毫伏，基于葡萄糖酸钾的内溶液的液接电位为60毫伏）。在所有记录中，神经元均以-70毫伏的电位通过由含丝的硼硅玻璃制成的膜片钳管（开路管电阻为2-4兆欧）进行钳制。对于所有CA1锥体神经元成对的双细胞全细胞记录，从相邻神经元进行记录增加了两个神经元均从同一群抑制性轴突获得突触输入的可能性，并确保两个神经元都暴露于相同的刺激幅度和强度。

使用BX51 WI立式显微镜（配有IR-1000红外CCD摄像头和60倍水浸物镜）进行记录。通过视频辅助红外微分干涉对比观察神经元，并使用由驱动的落射荧光来识别荧光。对于表达ChR2的突触小结的光刺激，通过反射光荧光照明端口和60倍物镜从发光二极管发出470纳米的蓝光。脉冲以0.4赫兹的频率传递。每次记录时，脉冲持续时间（0.1-0.2毫秒）和强度（1.3-5.9 mW/mm2)）都会进行调整，以诱发微小但可靠的单突触IPSC。在光遗传学刺激实验中未使用任何药物。

在电刺激实验中，通过置于锥体层或辐射层中心、距离所记录神经元对150-200微米处的θ型玻璃刺激电极施加电流。刺激强度为能同时在两个神经元中产生微弱但可靠电流的最小值。通过向人工脑脊液灌流液中加入10微摩尔的NBQX（1044）和10微摩尔的（R）-CPP（0247），实现IPSCs的药理学分离。为了特异性地分离CCK-IPSCs，除了阻断兴奋性电流外，还使用0.4微摩尔的ω-阿加托毒素IVA（4256-s）阻断PV-IPSCs，这是一种选择性P/Q型钙通道拮抗剂。通过加入10微摩尔的加巴嗪（1262）实现EPSCs的药理学分离。

对于同时进行的双全细胞记录，我们确定所测量的抑制性突触后电流（IPSCs）为单突触传递，因为在浴液中加入NBQX和（R）-CPP并未改变IPSCs的起始潜伏期。对于成对的中间神经元（IN）到CA1锥体神经元的记录，根据在脑片中预期的1-3毫秒的起始潜伏期，证实了IPSCs的单突触性质。

数据采集与分析。数据经Axon Multiclamp 700B放大器以4千赫兹低通滤波，并以10千赫兹采样，再通过Axon Digidata 1440A数据采集系统进行数字化处理，该系统由Clampex 10.6控制。若保持电流超过-500皮安或串联电阻大于30兆欧，则实验数据将被舍弃。对于CA1锥体神经元的双全细胞记录，若两个神经元之间的串联电阻差异超过30%，则记录数据也将被舍弃。所记录的曲线使用Clampfit 10.6或Axograph（1.7.6版）进行分析。所有电流幅度测量值均以平均值±标准误差表示，或以一对神经元之间的电流幅度差值除以两神经元总电流幅度（ΔIPSC/ΣIPSC）表示。差值（ΔIPSC）通过荧光标记（即经过处理的）细胞的电流减去对照（即未经处理的）细胞的电流计算得出，正数表示处理细胞的IPSC幅度大于对照细胞，反之亦然。

样本量并非预先确定，与文献中所报道的相似。先前的研究表明，通常情况下，从3-5只动物（N）中收集约15-20对神经元（n）就足以完成每项实验。除特别说明的情况（图4c-e）外，大多数数据并非在不知基因型或条件的情况下收集的，但所有离线分析均在盲态下进行。所有统计分析均使用Prism 8软件完成。数据的正态性通过D'Agostino-Pearson、Shapiro-Wilk和Kolmogorov-Smirnov正态性检验进行测试。对于同时双全细胞记录锥体神经元，使用双侧t检验或普通单向方差分析，并进行多重比较校正。对于单突触连接的记录，使用非参数双侧Mann-Whitney检验。采用混合模型来确认结果并非由单只小鼠所驱动。为确保数据集内各小鼠的样本量均衡，对每只小鼠记录的细胞数量进行了上限设定（例如，若使用N=4只小鼠获得n=20对，则每只小鼠使用4-6对）。

08.组织学

小鼠通过腹腔注射10毫克ml−1氯胺酮和1毫克ml−1赛拉嗪的PBS溶液进行麻醉。待完全麻醉后，将动物进行心脏灌注，先灌注5毫升冰冷的PBS，再灌注20毫升冷的4%多聚甲醛（PFA）PBS溶液。取出大脑，用4% PFA在4°C下固定24小时，随后用冷PBS冲洗三次（每次30分钟）。接着使用振动切片机切取40微米厚的冠状切片，并将其保存在4°C的PBS中，以备后续使用。进行免疫染色时，切片在含有0.3% Triton X-100的PBS中室温下通透30分钟。然后在含有0.3% Triton X-100、2%正常驴血清和0.1%鱼明胶的PBS中室温封闭1小时。切片在4°C下用稀释于封闭液中的初级抗体孵育48小时：兔抗FOS抗体（226003，1:3000）、鼠抗FOS抗体（ab208942，1:1000）、兔抗NPAS4抗体（1:1000）、兔抗FOSB抗体（2251S，1:1000）、兔抗JUNB抗体（3753S，1:1000），大鼠抗HA（ROA-HAHA，1:500），兔抗PV（PV27，1:10000），兔抗裂解型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（9661S，1:1000）和小鼠单克隆抗NeuN（MAB377，1:1000）。随后，切片在室温下用PBS洗涤三次，每次10分钟，然后在室温下与偶联了Alexa Fluor染料的二抗（；大鼠Alexa Fluor 555（A21434）、兔Alexa Fluor 488（A21206）、兔Alexa Fluor 555（A31572）、兔Alexa Fluor 647（A31573）、小鼠Alexa Fluor 555（A31570）、小鼠Alexa Fluor 647（A31571），1:250）孵育2小时，再用PBS洗涤三次。切片随后用DAPI Fluoromount-G封片，并在虚拟切片显微镜上成像。

09.小分子 RNA 原位杂交（smRNA-FISH）

样本制备时，将小鼠的海马半球在干冰上用 Tissue-Tek Cryo-OCT 包埋剂进行新鲜冷冻或固定冷冻，然后在 -80°C 下保存，以备后续使用。海马体切成 15 - 20 微米厚的切片，使用 RNAscope 试剂盒按照制造商的方案检测 RNA。Fos、Fosb 和 Junb 的探针由 Advanced Cell Diagnostics 公司专门设计，用于检测 Cre 重组酶表达时被切除的外显子。所用探针如下：Mm-Cre（546951）、Mm-Fos（584741）、Mm-Fosb（584751）、Mm-Junb（584761）、Mm-Scg2（477691）和 Mm-Scg2 内含子（859141）。所有原位杂交均使用共聚焦显微镜成像，并在 ImageJ（Fiji v1.0 版）中进行分析。

10.FFJ 小鼠品系中 Fos、Fosb 和 Junb 缺失的验证

通过 smRNA-FISH 在 RNA 水平和免疫染色在蛋白质水平上，证实了 Cre 表达后 Fos、Fosb 和 Junb 的高效切除。Fos 条件性敲除等位基因在 Cre 表达时可删除三个外显子，包括编码 3‘ UTR 的最后一个外显子，而 Fosb 和 Junb 条件性敲除等位基因则是单个外显子的删除（Fosb 为 4 个外显子中的第 2 个；Junb 仅为编码区）。因此，对于 smRNA-FISH，探针是专门设计来特异性靶向被切除的外显子的。需要注意的是，FFJ snRNA-seq 检测的是转录本的 3’ 端，因此对完整转录本的覆盖相对稀疏，尤其是在基因的 5‘ 端。因此，这种方法可用于确认 Fos 的删除，但不能用于 Fosb 和 Junb，因为条件性敲除等位基因的设计使得 Cre 切除后 Fosb 和 Junb 的 3’ 转录本保持完整，在文库制备过程中会产生非特异性的标签。

11.培养海马神经元及用于 RT-qPCR 或全转录组 RNA 测序的 RNA 提取

从 C57BL/6N 或 Scg2fl/fl 小鼠中分别在胚胎期 16.5 天或出生后 0 天取出海马体，然后用木瓜蛋白酶进行消化。通过将多个雌雄胚胎（混合性别培养）合并来生成培养物。加入卵粘蛋白（胰蛋白酶抑制剂）终止木瓜蛋白酶消化。用 P1000 移液管轻轻吹打细胞，并通过 40 微米滤网。将神经元接种到预先用聚-D-赖氨酸（20 毫克 ml−1 ）和层粘连蛋白（4 毫克 ml−1 ）过夜包被的细胞培养皿中。神经元在含有 B27 补充剂（2%）、青霉素（50 单位 ml−1 ）、链霉素（50 单位 ml−1 ）和谷氨酰胺（1 毫摩尔）的 Neurobasal 培养基中生长。神经元在 37°C 和 5% CO₂ 浓度的培养箱中培养。在所有实验中，独立重复实验均来自不同天数解剖的小鼠。神经元在 6 孔培养板中培养，每孔 100 万个神经元。在体外培养第 2 天（DIV2）用慢病毒上清液转导神经元，方法是用慢病毒上清液替换三分之一的 Neurobasal 培养基。在体外培养第 4 天（DIV4）添加新鲜培养基（占总体积的四分之一）。在 DIV7 时，用 55 毫摩尔/升的氯化钾使神经元去极化 1 小时或 6 小时，以分别评估即时早期或晚期反应的活动依赖性基因，随后在室温下用 Trizol 轻柔振荡 2 分钟来收获 RNA。按照制造商的说明使用 RNeasy Micro 试剂盒纯化不含 DNA 的 RNA。对于定量逆转录 PCR（RT-qPCR），使用高容量 cDNA 逆转录试剂盒将 200 纳克的 RNA 转换为 cDNA。RT-qPCR 以技术重复三次进行，并通过使用从 cDNA 系列稀释构建的标准曲线映射回相对 RNA 浓度。使用 qPCR 机器收集数据。对于总 RNA 测序，使用 100 纳克的 RNA 生成文库，按照制造商的说明进行 rRNA 脱除。在测序平台上生成 75 个碱基对的读取，并随后使用标准化的 RNA-seq 数据分析流程进行分析。

12.莫里斯水迷宫行为范式

FFJ 同窝小鼠（8 - 14 周龄）接受双侧 CA1 区（从眉间点算起的立体定位坐标为 AP -2 毫米，ML ±1.5 毫米，DV -1.3 毫米）注射 AAV-Cre-GFP 或 AAV-ΔCre-GFP。小鼠接受地塞米松和缓释丁丙诺啡注射，并在行为训练前恢复 1 - 2 周。水迷宫直径为 97 厘米，注入室温水，加入颜料使水浑浊，水深 40 厘米。在迷宫边缘 14 厘米处放置一个直径 7 厘米的隐藏平台，平台位于水面以下 1 厘米处。在测试室的四面墙上放置远端提示物。小鼠每天接受两组训练，连续训练四天（第 1 - 4 天）。每组训练包含四次试验。每次试验中，小鼠从八个（随机选择）起始位置之一放入水池，这些起始位置均匀分布在水池半圆周上，与隐藏平台所在的半圆周相对。小鼠有 60 秒时间找到平台。如果小鼠在规定时间内未找到平台，实验人员会引导其到达平台，并让其在平台上停留 10 秒。随后将小鼠从平台上移出，放入预热的笼子里晾干。在训练一天后（第 5 天）进行了两次 40 秒的探测试验，此时平台已被移除。试验过程中，小鼠的游泳路径由悬挂在迷宫中心上方几英尺处的摄像机记录下来。实验人员对小鼠的基因型一无所知。未游泳而漂浮的小鼠被排除在进一步分析之外。

分析。所有视频追踪和分析均使用定制的 MATLAB 代码进行。每只小鼠每次试验的游泳轨迹均半自动追踪，并手动校正。在本研究中，有一只小鼠由于追踪问题，第一天第二组的试验（第 5 至 8 次试验）被排除在分析之外，因此在第一天的性能指标中，这只小鼠仅考虑了 4 次试验。对于游泳速度和路径长度的分析，计算了每只小鼠在前两天所有试验的平均值，以控制探索水平的相似性。

13.核糖体相关 mRNA 分析

从小鼠身上迅速分离出海马组织，随后用于隔离与核糖体结合的 mRNA。按照先前描述的方法进行与核糖体结合的 mRNA 的免疫纯化，裂解缓冲液中加入 10 mM 核糖核苷酸钒复合物，并使用小鼠单克隆抗 HA 抗体（每次免疫沉淀 12 μg）。免疫沉淀前的小部分裂解液作为每个样本的输入。所有 RNA 样本（CaMK2a 为 20 ng；PV 为 2.5 ng）经分析具有足够的完整性，使用 SPIA 扩增。随后，使用超声破碎仪将 SPIA 扩增的 cDNA（1 μg）破碎至约 400 bp 的长度。破碎后的 cDNA（100 ng）生成了与测序兼容的测序文库。文库在测序平台上进行测序，生成 75 个碱基对的单端读段，每个样本的测序深度为 20 至 40 百万读段。

分析。如前所述，对每个样本在每个刺激时间点的 Ribotag 测序进行了分析。简而言之，长度≤75 个碱基对的原始测序读段在 3' 端被统一修剪至 70 个碱基对（忽略约 0.1% 短于该长度的读段），并进行质量控制过滤。然后使用 Burrows-Wheeler Aligner （bwa） 将其非方向特异性地映射到 mm10 基因组（GRCm38），允许最多 2 个错配且不允许有缺口。除了常规的组装染色体外，映射目标还包括线粒体 DNA 和一个约 700 万个短剪接位点序列的库。通常，75% - 80% 的读段可被映射；非唯一映射的读段以及任何映射到 rRNA 基因位点的读段均被丢弃。

基因特征基于 NCBI RefSeq 对 mm10 的注释中的外显子位点。基因外显子的平均表达密度被用作其表达水平的替代指标。然而，非编码基因（其中一些在不同样本中的表达量相当高且变化很大）未纳入这些分析。每个基因的剪接位点靶序列由所有可能的两个或多个有序外显子的最小长度子序列组成，这些子序列的边界会被 70 个碱基对的读段跨越。这提供了一套详尽且无冗余的可预测的跨越外显子连接位点的位点，这些位点通常占成熟信息中所有外显子读段的约 20%。

差异表达分析采用 R 语言中的软件，将海人酸刺激 6 小时后的所有生物学重复样本的转录水平与未刺激样本进行比较。如果（1）由计算得出的表达变化的 Benjamini-Hochberg 校正 P 值（q 值）与 FDR（错误发现率）≤0.005 相一致，且（2）通过了适度的背景过滤（所有比较样本中的总读数≥4），则该基因的表达水平被标记为显著变化。

14.细胞核分离

从小鼠身上快速分离海马组织，并用捣碎器匀浆。匀浆在缓冲液 HB（0.25 M 蔗糖、25 mM KCl、5 mM MgCl2、20 mM Tricine-KOH，pH 7.8，补充有蛋白酶抑制剂、1 mM DTT、0.15 mM 精胺和 0.5 mM 精脒）中进行，使用紧杵捣碎 20 次，总体积为 1.5 毫升。然后向组织中加入 96 微升 5% IGEPAL CA-630，并用紧杵再捣碎 5 次。匀浆通过 40 微米的滤网过滤以去除大颗粒杂质，收集到 15 毫升锥形管中，然后加入 3.5 毫升缓冲液 HB 和 5 毫升工作液（50% 碘代葡胺与 25 mM KCl、5 mM MgCl2、20 mM Tricine-KOH，pH 7.8，补充有蛋白酶抑制剂、DTT、精胺和精脒）。匀浆组织下垫 1 毫升 30% 碘代葡胺和 1 毫升 40% 碘代葡胺（从工作液中稀释）溶液。样品以 10,000g 离心 18 分钟。分别在 30/40% 碘代葡胺界面收集 70 微升或 250 微升体积的细胞核，用于实验。

15.FFJ 小核仁 RNA 测序

FFJ snRNA-seq 实验采用 Chromium 单细胞试剂盒（v3 版）进行。在将细胞核加载到微流控芯片之前，向逆转录混合液中加入约 7000 至 10000 个细胞核。每个 snRNA-seq 样本由两只小鼠的细胞核混合而成。cDNA 合成、cDNA 扩增和文库制备的所有后续步骤均按照制造商的说明进行。所有样本在测序平台上进行测序，读长分别为 58 个碱基（读段 1）、26 个碱基（读段 2）和 8 个碱基（索引）。

分析。初始的 FASTQ 文件是使用标准的测序管道生成的，每个条形码的基因表达表是根据提供的说明生成的。通过检测所有用于本研究的腺相关病毒（AAV）中都存在的 WPRE-bGH 多聚腺苷酸序列的 mRNA 物种的存在来检测 AAV 转导的细胞。使用定制引物对 WPRE 转录本进行 PCR 扩增。然后将基因表达表导入 R 并使用自定义编写的功能进行分析。排除标准：如果细胞核中发现的基因少于 500 个或有超过 5% 的读取映射到线粒体基因，则从数据集中移除该细胞核。一般分析参数：原始 UMI 计数被标准化为每细胞 10-4 UMI（即每万个标签，TPT）。为了进行降维和聚类，将所有 Cre（或所有 ΔCre）小鼠的细胞核合并。使用 Find-VariableFeatures 函数（selection.method = 'vst', nFeatures = 2000）识别高变基因，该函数在分析的细胞核中识别出 2000 个最可变的基因。基于 2000 个变异最大的基因，使用 RunPCA 函数进行了主成分分析，以降低数据集的维度。保留了前 20 个主成分，并使用 RunUMAP 函数实现的均匀流形近似和投影（UMAP）算法将其投影到二维空间（n.neighbours = 50，min.dist = 0.5）。以下基因被用作指南，以将细胞类型身份分配给基于图的聚类：泛兴奋性神经元（Slc17a7）；CA1 兴奋性神经元（Fibcd1，Mpped1）；CA3 兴奋性神经元（Spock1，Cpne4）；兴奋性齿状回（Prox1，C1ql2）；泛抑制性中间神经元（Gad2，Slc32a1）；Sst+中间神经元（Sst）；Pvalb+中间神经元（Pvalb）；Vip+中间神经元（Vip）；Cck+中间神经元（Cck）；Nos1+中间神经元（Nos1），Npy+中间神经元（Npy）；少突胶质细胞（Aspa，Opalin，Gjb1）；少突胶质细胞前体细胞（Gpr17，C1ql1）；小胶质细胞（Cx3cr1，C1qc）；内皮细胞（Ly6c1，Cldn5）；星形胶质细胞（Cldn10，Gjb6，Gfap）。差异基因表达分析：通过 FindMarkers 函数（logfc.threshold = 0.01，pseudocount.use = 0.001）实施的 Wilcoxon 秩和检验计算了 Cre 或 ΔCre 样本中在相应未转导对照细胞中检测到的基因表达变化的统计学意义，这些基因在大于 5%的对照细胞中被检测到。使用默认参数通过 VlnPlot 函数生成小提琴图，并使用 R 语言中自定义编写的函数生成热图。热图显示了从每个指定细胞身份中随机选取的 100 个细胞的归一化基因表达值，所显示的基因是 AP-1 目标基因，在 FFJ KO (Cre+) 中表达至少降低 20%，且在至少 25%的分析细胞核中被检测到。

16.切割与跑开

从注射生理盐水或海人酸 2 - 3 小时后的 CaMK2aCre/+;LSL-Sun1-sfGFP-Myc/+ 小鼠海马核中分离出核，如上文所述。将分离出的核用两倍体积的 CUT&RUN 洗涤缓冲液（含 4 mM EDTA）稀释，并用 1:500 稀释的 DRAQ5 染色。CaMK2a+ (GFP+) 由 CaMK2a-Cre 介导表达 SUN1-sfGFP-MYC 的核通过流式细胞术使用 SH800Z 细胞分选仪分离，随后使用分析。分选后的核用 1 毫升冷 CUT&RUN 洗涤缓冲液（20 mM HEPES pH 7.5，150 mM NaCl，0.2% Tween-20，1 毫克 ml−1 BSA，10 mM 丁酸钠和 0.5 mM 精胺，含蛋白酶抑制剂）重悬，每个反应使用 50,000 个核。核与用 CUT&RUN 结合缓冲液（20 mM HEPES-KOH pH 7.9，10 mM KCl，1 mM CaCl2，1 mM MnCl2)）洗涤过的磁性刀豆蛋白 A（ConA）珠结合。随后，将结合了 ConA 磁珠的细胞核在冷 CUT&RUN 抗体缓冲液（CUT&RUN 洗涤缓冲液中添加 0.1% Triton X-100 和 2 mM EDTA）中孵育过夜，并加入自制的兔多克隆抗 FOS 抗体（亲和层析洗脱 1096，1:100）或兔 IgG 抗体（2729，1:100）。抗体孵育后，将与刀豆蛋白 A 磁珠结合的细胞核用 CUT&RUN 抗体缓冲液洗涤，然后用 CUT&RUN Triton 洗涤缓冲液（CUT&RUN 洗涤缓冲液中添加 0.1% Triton X-100）重悬，并加入最终浓度为 700 ng ml−1 的蛋白 A - MNase。样品在 4 °C 下孵育 1 小时。接着，将与刀豆蛋白 A 磁珠结合的细胞核用 CUT&RUN Triton 洗涤缓冲液洗涤两次，最终重悬于 100 μl 的 CUT&RUN Triton 洗涤缓冲液中。向每个样品中加入 3 μl 的 100 mM CaCl2，在冰上孵育 30 分钟。通过加入 100 μl 的 2× STOP 缓冲液（340 mM NaCl、20 mM EDTA、4 mM EGTA、0.04% Triton X-100、20 pg ml−1 酵母内参 DNA 和 0.1 μg ml−1 RNase A）并在 37 °C 下孵育 20 分钟来终止反应。孵育结束后，用磁铁捕获刀豆蛋白 A 磁珠，收集含有蛋白 A - MNase 释放的 DNA 片段的上清液。然后，向上清液中加入 2 μl 的 10% SDS 和 2 μl 的 20 mg ml−1 蛋白酶 K，在 65 °C 下温和振荡孵育 1 小时。随后，使用标准酚/氯仿提取法并用乙醇沉淀来纯化 DNA。最后，将 DNA 重悬于 30 μl 的 0.1× TE 缓冲液中。CUT&RUN 测序文库的构建基本按照先前的描述进行，但有以下改动：使用 Rapid T4 DNA 连接酶将接头连接到末端修复并 A 尾化的 DNA 上。对 PCR 扩增后的文库，使用 1.1× 比例的 AMPure XP 磁珠去除接头二聚体，用 20 μl 的 10 mM Tris pH 8.0 溶液洗脱。所有 CUT&RUN 文库在测序平台上进行测序，采用 40 bp 的双端读取。

分析。经过解复用后，使用 Trimmomatic 和 kseq 对测序读段进行质量修剪和去除剩余的接头序列。修剪后的读段使用 Bowtie2 对 mm10 基因组进行比对，参数设置为：-local -very-sensitive-local -no-unal -dovetail -no-mixed -no-discordant -phred33 -I 10 -X 700。修剪后的读段也使用相同的参数对 sacCer3 基因组进行比对，以恢复与 CUT&RUN 中使用的酵母内参 DNA 相对应的读段。使用 Bedtools 的 genomecov 生成全基因组范围内的 CUT&RUN 片段覆盖度，并根据每个样本获得的酵母内参读段数量进行标准化。使用 IGV 可视化标准化覆盖度轨迹，代表所有三个生物学重复的平均信号。使用 Deeptools 的 multiBigwigSummary 确定全基因组范围内 100-bp 窗口的 CUT&RUN 覆盖度，并用于计算每种抗体和刺激条件下的重复样本对之间的皮尔逊相关性。使用 SEACR 对 FOS CUT&RUN 进行峰识别，参数设置为：norm， relaxed。使用兔 IgG 进行的 CUT&RUN 实验被用作峰检测的阴性对照样本。随后对峰进行过滤，以识别在每种条件下所有三个生物学重复样本中均存在的峰，从而创建了一组保守的 FOS 结合位点。使用 Bedtools merge 将彼此距离在 150 个碱基对以内的峰进行合并。首先将峰以 CUT&RUN 信号在峰内的最大值为中心，然后使用 Deeptools computeMatrix 计算峰中心上下游 1000 个碱基对范围内 50 个碱基对的 CUT&RUN 覆盖率。对每个峰的每个区间内的覆盖率进行平均，然后使用 R 中的 ggplot2 绘制平均区间覆盖率图。

为确定 TSS 与 FOS 结合位点之间的距离，获取了 Refseq、活动调节型（CaMK2a-Ribotag）以及 CA1 兴奋性神经元特异性 AP-1 调节型（FFJ snRNA-seq）基因的 TSS 位置。使用 Bedtools closest 计算 FOS 结合位点与最近的 TSS 之间的距离。利用 R 中的 ggplot2 绘制 FOS 结合位点与 TSS 之间距离的直方图。我们使用 R 中的 Wilcoxon 秩和检验来确定 Refseq、CaMK2a-Ribotag 和 FFJ snRNA-seq 基因的距离分布差异的统计学意义。

为了识别 FOS 结合位点内富集的转录因子基序，使用 Bedtools 的 getfasta 命令获取 FOS 峰中心上下游 250 个碱基对的基因组序列，并将其作为 MEME-ChIP 的输入。基序搜索针对 HOCOMOCO Mouse v11 CORE 数据库进行，允许每个序列出现多个基序，并使用所有其他参数的默认设置。报告了 E 值最低的三个基序。

17.NE 小核仁 RNA 测序

C57BL/6J 小鼠接受短暂的 5 分钟去甲肾上腺素刺激，随后返回其饲养笼 1 小时或 6 小时，之后收集海马组织。按照上述方法从海马组织中分离细胞核，并使用平台进行 snRNA-seq 测序。总共 23,610 个细胞核，每个细胞的 RNA 分子计数范围为 700 至 15,000，每个细胞的基因种类范围为 200 至 2,500 种，使用 UMAP 算法将其聚类为约 13 种细胞类型。使用 Slc17a7、Fibcd1 和 Pex5l 基因作为指南，将背侧 CA1 兴奋性神经元簇的细胞类型身份进行分配。每个基因的原始 UMI 计数被归一化为每个细胞的总 UMI 计数。使用 Wilcoxon 秩和检验测量差异基因表达和统计学意义。每种条件下使用下采样后的 1,659 个 CA1 兴奋性细胞核。

18.免疫印迹法

从 293T 细胞中提取的全细胞裂解物是通过将细胞在沸水中的 Laemmli SDS 裂解缓冲液（4% SDS、20% 甘油、10% 2-巯基乙醇、0.004% 溴酚蓝、0.125 M Tris HCl pH 6.8）中快速裂解获得的。蛋白质提取物在 4 - 12% 的 Bis-Tris 梯度凝胶（扩展数据图 7c）或 8% 的 Tris-Glycine 凝胶（扩展数据图 9g）上进行分离，随后转移到硝酸纤维素膜上。将膜在以下一抗中孵育过夜：小鼠抗-MYC（9E10，扩展数据图 7c，1:1000）或小鼠抗-HA（H3663，扩展数据图 9g，1:1000）以及兔抗-GAPDH（G9545，1:2000）。洗涤后，将膜与偶联了 IRDye 800CW 的二抗（小鼠（926-32210），兔（926-32211），1:5000）一起孵育，然后用成像系统进行成像。

19.体内硅探针记录

对于所有在体电生理记录，8 - 10 周龄的 Scg2fl/fl 小鼠接受了两次立体定向手术。在第一次手术中，将 AAV-Cre-GFP 或 AAV-ΔCre-GFP 注射到 CA1 区，并在 CA1 区未来硅探针植入部位（立体定向坐标约为前额 -2 毫米，左右 ±1.8 毫米）在颅骨表面做了标记。使用钛制头板固定在颅骨上，并覆盖其余暴露的颅骨。给小鼠注射地塞米松和缓释丁丙诺啡，让其恢复 1 - 2 周，在此期间，小鼠每天接触 NEs 并适应在空气支撑的泡沫塑料球上固定头部。在记录当天，在颅骨上标记的左或右半球的其中一个位置进行第二次手术（开颅术）。开颅术部位用覆盖，小鼠完全从麻醉中恢复至少 4 小时后，将 64 通道硅探针插入皮质，并缓慢降至 CA1 锥体层下方约 1.25 - 1.5 毫米处。在某些情况下，将 2%（质量体积比）的熔化琼脂糖涂于头板孔中以固定探针。当探针推进至 CA1 锥体层时停止，这由θ波振荡的存在以及多个通道中高密度的多单元出现得以证实。所有数据均以 20 千赫兹的频率进行数字化采集（Intan Technologies RHD2000 记录系统）。

分析。所有数据分析均使用定制的 MATLAB 脚本完成。位于 CA1 区域之外的通道被排除在分析之外。进行尖峰分类，随后进行手动检查和聚类整理。仅选择分离良好的单元进行进一步分析。此外，单个单元还必须满足以下标准：在少于 20 个通道上检测到，半峰宽小于 1 毫秒，在会话期间检测到至少 1000 个尖峰，以及总体放电频率大于 0.01 次尖峰 s−1 。根据先前的描述，基于尖峰谷到峰的持续时间将单元分为假定的兴奋性和抑制性亚类，使用 0.7 毫秒的截止值，低于该值的单元被标记为抑制性中间神经元（IN）。由于记录到的抑制性 IN 数量较少，因此将其排除在分析之外。对于局部场电位（LFP）分析，将每个通道的数据进行滤波并下采样至 1000 赫兹。对于θ相位锁定分析，仅使用跑步期间的数据进行分析。在锥体层内选择单个通道作为参考。对 LFP 进行滤波，并使用希尔伯特变换确定相位。每个神经元的首选相位是通过在 MATLAB 中计算每个脉冲相位的圆均值来确定的。为了比较野生型（WT）和基因敲除（KO）组中单个细胞的特性，将来自不同小鼠的细胞合并在一起。使用多窗谱估计方法（时间带宽 = 5，窗函数 = 3）计算 1 至 120 赫兹范围内的功率谱。由于应用了 59 至 61 赫兹的陷波滤波（二阶巴特沃斯滤波器）以去除噪声，因此在所有后续分析中排除了 58 至 62 赫兹范围内的功率。对每个通道分别计算功率谱，然后在通道间取平均值。为了在不同小鼠和不同实验会话之间进行比较，将每个会话的功率谱通过除以功率谱中所有频率（1 至 120 赫兹范围）的总和进行归一化处理。以单个单元为基础，通过在跑步期间对每个 10° 相位区间内的脉冲进行求和，然后除以所有区间脉冲的总和，来计算脉冲数量与θ相位的函数关系。

东莞富临医疗科技有限公司是英坦科技（Intan Technologies）在亚洲的代理商， 为亚洲客户提供“技术服务”与供应“电生理产品”

公司地址：广东省东莞市樟木头镇塑金国际1号楼810

发布于：广东省